分子杂交的几种常用杂交技术
(1) Southern杂交:电泳分离DNA片段，从凝胶上转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。检测的对象是DNA，探针是DNA或RNA。
(2) Northern杂交:电泳后将RNA片段从凝胶上转移到硝酸纤维素滤膜上，然后与探针杂交。检测的对象是RNA，探针是DNA或RNA。
根据杂交使用的方法，还有点杂交、槽杂交和菌落原位杂交。三种固相支持物可用于杂交:硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman 541滤纸。不同品牌的尼龙膜需要区别对待，DNA固定和杂交要严格按照厂家说明书进行。Whatman 541滤纸湿强度高，最早用于筛选细菌菌落。滤纸主要用于筛选一些基因文库。固定化DNA的杂交条件基本上与使用硝酸纤维素滤膜时建立的条件相同。Whatman 541滤纸与硝酸纤维素滤膜相比有一些优势:更便宜，杂交更耐用，干燥过程中更不容易变形碎裂。然而，如果变性过程不小心，杂交信号的强度将明显弱于使用硝酸纤维素滤膜获得的信号。因此，硝酸纤维素滤膜仍被用作常规细菌筛选和各种杂交的固相支持物。Southern杂交可用于检测限制性内切酶切割的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，包括以下步骤:
(1)酶切DNA，凝胶电泳分离酶切片段，然后原位变性DNA。
(2)将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。
(3)预杂交滤膜以覆盖滤膜上的非特异性位点。
(4)将探针与同源DNA片段杂交，然后冲洗除去非特异性结合的探针。
(5)通过显影检查靶DNA的位置。
Southern杂交能否检测到杂交信号取决于许多因素，包括靶DNA在总DNA中的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与靶DNA之间的配对。在最佳条件下，经过几天的放射自显影曝光后，Southern杂交可以灵敏地检测到活性小于0.1pg的高活性探针和32 P标记(>:109 cpm/μg)互补DNA的比活性。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，与长度为几百个核苷酸的探针杂交，暴露过夜，可以在哺乳动物基因组中检测到大小为1kb的单拷贝序列。
DNA从凝胶转移到固相支持物上主要有三种方法:(1)毛细管转移。这种方法是南方人发明的，所以也叫南方转移(或印迹)。毛细管转移法的优点是简单，不需要其他仪器。缺点是转移时间长，转移后杂交信号弱。(2)电泳转移。DNA变性后，可以通过电泳转移到带电的尼龙膜上。这种方法的优点是不需要脱嘌呤/水解，可以直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流大，温度难以控制。电泳转移通常仅在毛细管转移和真空转移无效时使用。(3)真空转移。有许多商业真空转移仪器。一般他们把硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上方的多孔网上，然后把凝胶放在滤膜上，缓冲液从上方的储液槽流下来，洗脱凝胶中的DNA，沉积在滤膜上。这种方法的优点是快速，它可以从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(
1，材料:待测DNA，标记探针。
2.设备:电泳仪、电泳槽、塑料盆、真空炉、放射自显影盒、x光片、杂交袋、硝酸纤维素膜或尼龙膜、滤纸。
3.试剂:
(1)10毫克/毫升溴化乙锭(EB)。
(2)50×Denhardt溶液:5克Ficoll-40，5克PVP，5克BSA加水至500毫升，过滤灭菌，保存于-20℃。
(3)1×布洛托:脱脂奶粉5g，0.02%叠氮化钠，4℃保存。
(4)预杂交液:6× SSC，5× Denhardt，0.5% SDS，100 mg/ml鲑鱼精DNA，50%甲酰胺。
(5)杂交液:在预杂交液中加入变性探针即为杂交液。
(6)0.2摩尔/升盐酸.
(7)0.1%十二烷基硫酸钠.
(8)0.4摩尔/升氢氧化钠.
(9)变性溶液:将87.75克氯化钠、20.0克氢氧化钠加水至1000毫升。
(10)中和溶液:175.5g NaCl，6.7g Tris Cl Cl，加水至1000ml。
(11)硝酸纤维素滤膜。
(12) 20× SSC: 3 mol/L NaCl，0.3 mol/L柠檬酸钠，用1mol/L HCl调节pH至7.0；
(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC稀释。
4、操作步骤:
(1)将10pg-10μg的DNA以约50μl的体积消化，然后在琼脂糖凝胶中电泳12-24小时(包括DNA分子量标准)。
(2)将25μl 10mg/ml溴化乙锭加入500 ml水中，将凝胶放入其中染色30分钟，然后拍照。
(3)依次用下列溶液处理凝胶，轻轻摇匀:500ml 500ml 0.2mol/L HCl 10+00分钟，倒掉溶液(若限制性片段>:10kb，酸处理时间为20分钟)，水洗数次，倒掉溶液；500ml变性溶液两次，每次15分钟，将溶液倒掉；500毫升中和溶液30分钟。如果用尼龙膜杂交，这一步可以省略。
(4)戴上手套，向皿中加入20×SSC溶液，先用无菌水将硝酸纤维素滤膜完全浸湿，再用20×SSC浸湿。将硝酸纤维素滤膜一次准确覆盖在凝胶上，去除气泡。用浸泡在20×SSC溶液中的3张滤纸覆盖滤膜，然后加入干燥的3张滤纸和干纸巾，根据DNA的复杂程度，转移2-12小时。使用尼龙膜杂交时，可将膜在水中浸泡一次，转移时用0.4mol/L NaOH代替20×SSC。简单的印迹转移需要2-3个小时，对于基因组印迹，通常需要很长时间才能转移。
(5)取下纸巾，用蓝色圆珠笔在滤膜右上角写下转移日期，做好标记，取出滤膜，在2×SSC中清洗5分钟，晾干后80℃烘烤2小时。注意，用尼龙膜杂交时，只能风干，不能烘烤。
(6)将滤膜放入装有6-10ml预杂交液的密封小塑料袋中，将预杂交液加入袋底，来回挤压袋子，使滤膜湿润。在一定温度下(一般为37-42℃)预杂交3-65438±02小时，弃去预杂交液。
(7)准备同位素标记探针(见第1节)，并将探针煮沸5分钟。
(8)将探针加入杂交液中，混合均匀。如步骤(6)中所述，将混合溶液注入密封的塑料袋中，并在与预杂交相同的温度下杂交6-65438±02小时。
(9)取出滤膜，依次用下列溶液处理，轻轻摇匀:室温下，1× SSC/0.1% SDS，15分钟，两次。在杂交温度下，0.25× SSC/0.1% SDS，15分钟，两次。
(10)风干硝酸纤维素滤膜，然后在x光片上曝光。DNA条带通常在暴露于1-2天后可见。对于从gap翻译过来的≥108 cpm/μg的探针，从10μg哺乳动物DNA中很容易检测到10pg的单拷贝基因。北方杂交和南方杂交非常相似。主要区别在于检测的对象是RNA，其电泳是在变性条件下进行，去除RNA中的二级结构，保证RNA按照分子大小完全分离。变性电泳有三种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后，RNA以与Southern转移相同的方式通过琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维素膜上，然后与探针杂交。
1.材料:待测RNA和制备的探针。
2.设备:电泳仪、电泳槽、塑料盆、真空炉、放射自显影盒、x光片、杂交袋、硝酸纤维素膜或尼龙膜。
3.试剂:
(1)20×SSPE:175.3g NaCl，88.2 g柠檬酸钠，溶于800ml水中，用10mol/LNaOH调节pH值至7.4，最后溶解至1L。
(2)其他试剂:类似于Southern杂交试剂，除了所有试剂都用DEPC处理。
4、操作步骤:
(1)RNA经变性和电泳后，乙醛酰基RNA可立即转移到硝酸纤维素滤膜上。转移方法类似于转移DNA的方法。
(2)转移后，在室温下将膜浸泡在6×SSC溶液中5分钟，以去除琼脂糖片段。
(3)将杂化膜夹在两张滤纸之间，在80℃的真空烘箱中干燥0.5-2小时。
(4)与以下两种溶液之一预杂交1-2小时。如果在42℃，50%甲酰胺，5×SSPE，2×登哈特氏试剂，0.1% SDS条件下进行；应该使用；如果在68℃下进行，应使用6×SSC、2×Denhardt氏试剂和0.1% SDS(注:BLOTTO不能用于Northern杂交)。
(5)向预杂交溶液中加入变性的放射性标记的探针。如果要检测低丰度mRNA，所用探针的量至少应为0.1μg，其比活性应大于2×108 cpm/ min μ g，并将其置于合适的温度条件下杂交16-24小时。
(6)室温下用1×SSC和0.1% SDS洗膜20分钟，然后在68℃下用0.2×SSC和0.1% SDS洗膜三次，每次20分钟。
(7)用x光胶片(柯达XAR-2或同等产品)进行放射自显影，并在附加增感屏的情况下在-70℃下曝光24-48小时。
[注意]
(1)如果琼脂糖浓度高于1%，或者凝胶厚度大于0.5cm，或者待分析的RNA大于2.5kb，则需要用0.05mol/LNaOH浸泡凝胶20分钟，使RNA部分水解，提高转移效率。浸泡后，用DEPC处理的水洗涤凝胶，并用20×SSC浸泡45分钟。然后转移到滤膜上。
(2)在步骤(3)的操作中，如果滤膜含有乙醛酰基RNA，杂交前要用20 mmol/L tris Cl (pH 8.0)在65℃下冲洗滤膜，以去除RNA上的乙二醛分子。
(3)将RNA从凝胶转移到尼龙膜上的方法与将RNA转移到硝酸纤维素滤膜上的方法相似。
(4)在RNA转移之前，含有甲醛的凝胶需要用DEPC处理的水洗涤几次以除去甲醛。使用尼龙膜进行杂交时，要注意一些带正电荷的尼龙膜在碱性溶液中具有固定核酸的能力，要用7.5mmol/LNaOH溶液洗脱琼脂糖中的乙醛酰基RNA，同时可以部分水解RNA，增加RNA分子长度(>:2.3kb)的转移速度和效率。此外，碱可以去除mRNA分子的乙二醛加合物，省去了固定后洗脱的步骤。在碱性条件下将乙醛酰基RNA转移到带正电荷的尼龙膜上的操作也是通过DNA转移进行的，但转移缓冲液是7.5mmol/LNaOH。转移后(4.5-6.0小时)，尼龙膜需要用2×SSC和0.1%SDS漂洗一段时间，室温下晾干。
(5)尼龙膜的缺点是背景高，尤其是使用RNA探针时。将滤膜长时间置于高浓度碱性溶液中会导致杂交背景明显升高，可通过增加预杂交和杂交步骤中封闭剂的用量来解决。
(6)如果使用中性缓冲液进行RNA转移，转移后，将干燥的尼龙膜夹在两张滤纸之间，在80℃下干燥0.5-2小时，或者用波长为254nm的紫外线照射尼龙膜的含RNA面。后一种方法更复杂，但它是优选的，因为某些批次的带正电荷的尼龙膜的杂交信号在这种处理后可以增强。但为了获得最佳效果，需要保证尼龙膜不过度曝光。适度照射可促使RNA上的少量碱基与尼龙膜表面带正电荷的氨基形成交联结构，而过度照射则使RNA上的一部分胸腺嘧啶与尼龙膜表面结合，导致杂交信号减弱。该方法可用于克隆和筛选分散在几个琼脂平板上的少数菌落(100-200)。将这些菌落合并到主琼脂平板中，并将硝酸纤维素滤膜置于第二个琼脂平板的表面上。培养一段时间后，菌落被原位裂解。主板应储存在4℃下，直到获得筛选结果。
1.材料:待测细菌平板、标记探针、硝酸纤维素滤膜等。
2.设备:恒温烘箱、恒温水浴、台式高速离心机等。
3.试剂:
(1)磅固体培养基。
(2)0.5摩尔/升氢氧化钠.
(3)1摩尔/升Tris Cl .
(4)1.5摩尔/升氯化钠.
(5)0.5摩尔/升Tris Cl .
(6)预洗液:5× SSC，0.5% SDS，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)。
(7)预杂交溶液:50%甲酰胺，6×SSC(或6×SSPE)，0.05×BLOTTO(不需要甲酰胺)。
(8)其他试剂:同Southern杂交。
4、操作步骤:
1.将一些菌落转移到硝酸纤维素滤膜上:
(1)将硝酸纤维素滤膜放在含有选择性抗生素的琼脂平板上。
(2)用无菌牙签将每个菌落转移到滤膜上，然后转移到含选择性抗生素但无滤膜的琼脂主板上。线状接种(或点状接种)要按照一定的网格进行。每个菌落应标记在两个平板的相同位置。最后，在滤膜和主板上同时画出含有非重组质粒(如pBR322)的菌落。
(3)将平板倒置，在37℃下培养，直到有标记的菌落长到宽度为0.5-65438±0.0毫米..
(4)用带有防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜，直至到达琼脂，并在三个以上不对称位置进行标记。在大致相同的位置标记主板。
(5)用石蜡膜密封主板，在4℃下倒置保存，直到获得杂交反应结果。
(6)溶解细菌，并根据本段以下描述的方法将释放的DNA与硝酸纤维素滤膜结合。
2.菌落裂解和DNA与硝酸纤维素滤膜的结合
(1)在一张保鲜膜上做一个装满0.5mol/L NaOH的小凹陷(0.75ml)，使菌落朝上，将滤膜放在凹陷处，压平保鲜膜，使滤膜均匀湿润，将滤膜放在原处2-3分钟。
(2)用干纸巾从滤膜下部吸干滤膜，用新的保鲜膜和新配的0.5mol/L NaOH重复步骤(1)。
(3)吸干滤膜，并将其转移至新的含1 mol/L tris Cl (pH 7.4)的塑料膜凹陷处。5分钟后，吸干滤膜，再次重复此步骤。
(4)吸干滤膜，转移到含有1.5mol/L NaCl和0.5 mol/L Tris Cl (pH 7.4)的保鲜膜上5分钟，然后吸干滤膜，转移到一张钱滤纸上，室温放置20-30分钟，使滤膜干燥。
(5)将滤膜夹在两张干燥滤纸之间，在80℃的真空烘箱中干燥2小时以固定DNA。
(6)将固定在膜上的DNA与32 p标记的探针杂交
交叉
(1)用一个装有2×SSC的塑料托盘，将烘干的滤膜漂浮在液面上，并充分浸泡5分钟。
(2)将滤膜转移到装有200毫升预洗液的玻璃皿中。滤膜叠在一起，放入溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿，放在培养箱内的旋转平台上。在50℃下处理30分钟。在此步骤和所有后续步骤中，应缓慢摇动滤膜，以防止它们粘在一起。
(3)用浸过预洗液的脱脂棉纸轻轻擦去膜表面的细菌碎片，以降低杂交背景，而不影响阳性杂交信号的强度和清晰度。
(4)将滤膜转移到含有150ml预杂交液的玻璃上，在合适的温度下预杂交1-2h(即水溶液杂交68℃，50%甲酰胺杂交42℃)。
(5)将32 P标记的双链DNA探针在100℃加热5分钟，迅速放入冰浴中。单链探针不必变性。将探针加入杂交袋中，杂交过夜。杂交时，装有滤膜的容器应盖紧，以防液体蒸发。
(6)杂交后，移去杂交液，立即将滤膜放入室温下2×SSC和0.1% SDS的大体积(300-500ml)溶液中，轻轻摇动5min，至少翻转滤膜一次。重复清洗一次，同时避免膜变干。
(7)用300-500毫升1× SSC和0.1% SDS溶液在68℃下清洗膜两次，每次1-1.5h..此时可以进行放射自显影。如果背景很高或实验要求严格，可用300-500 ml的0.2× SSC和0.1% SDS溶液在68℃浸泡滤膜60分钟。
(8)将滤膜放在纸巾上室温晾干，然后将滤膜(编号向上)放在一张保鲜膜上，在保鲜膜上做几个不对称的标记，使滤膜与放射性放射自显影胶片的位置相对应。
(9)用第二层塑料薄膜覆盖滤膜。用X线胶片和增感屏在-70℃下曝光12-16小时。
(10)底片显影后，在底片上贴一张透明纸板。在纸上标出杂交阳性信号的位置，同时标出不对称分布点的位置。可以将透明纸从阴性中取出，阳性菌落可以通过将纸上的点与琼脂上的点进行比较来鉴定。点杂交是将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特定的DNA或RNA。通过在不同时间稀释相同的样品可以获得半定量结果。因此，分析DNA或RNA是一种简单、快速、经济的方法，常用于基因分析和基因诊断，是研究基因表达的有力工具。但是，因为靶序列没有与非靶序列分开，所以不能知道靶序列的长度。特别是当背景干扰较大时，很难区分目标序列信号和干扰信号。
1.材料:待分析的DNA或RNA样品，标记探针。
2.设备:槽式采样器、真空泵、恒温水浴、真空炉等。
3.试剂:
(1)100%甲酰胺。
(2)甲醛(37%)。
(3) 20×SSC .
(4)0.1摩尔/升氢氧化钠.
(5)硝酸纤维素滤膜。
(6)滤纸。
4、操作步骤:
(1) 10μl样品与20μl 100%甲酰胺、7μl 37%甲醛和2μl 20×SSC混合。混合后放入68℃的冰浴中15分钟。
(2)用0.1mol/L NaOH清洗取样器，然后用无菌水充分冲洗。在取样器上铺一张20×SSC浸泡过的滤纸，再铺一张20×SSC浸泡过的硝酸纤维素滤膜1小时，盖好夹好，打开真空泵。
(3)用10×SSC清洗每个孔。向每个样品中加入两倍体积的2×SSC，混合后将样品加入孔中。将2μl染料加入几个外围孔定位，慢慢吸。用1毫升10×SSC清洁每个孔两次。继续抽吸5分钟，吸干滤膜。
(4)取出滤膜，夹在两张滤纸中间，在80℃真空干燥2小时。如上文Southern或Norhtern杂交中所述，与放射性标记的探针杂交。
[注意]
1.放射自显影时，要注意滤膜一定要干燥，并用保鲜膜覆盖，否则滤膜会粘在x光片上，给以后的操作带来困难。
2、在杂交过程中，整个滤膜应始终保持湿润，不能干燥。
第三节杂交反应条件和参数的优化
不同反应条件对杂交结果的影响如下:
(1)根据杂交液的体积确定杂交时间:一般来说，使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积的溶液中，核酸配对的速度较快，探针的用量较少，这样滤膜上的DNA在反应中起主要作用。但在杂交过程中需要保证有足够的杂交液覆盖杂交膜。
(2)根据使用的杂交液确定杂交温度:一般来说，杂交相为水溶液时，68℃杂交，在50%甲酰胺溶液中时，42℃杂交。
(3)选择不同的封闭试剂，如登哈特试剂、肝素或由5%脱脂奶粉组成的BLOTTO。这些试剂需要加入破碎的鲑鱼精子DNA或酵母DNA，与SDS一起使用。与Denhardt的试剂相比，BLOTTO便宜易用，也能获得满意的结果，但不能用于RNA杂交。一般来说，尼龙膜用Denhardt氏试剂比用BLOTTO能得到更高的信噪比。对于硝酸纤维素滤膜，封闭剂通常包含在预杂交溶液和杂交溶液中。但对于尼龙膜，杂交液中往往省略封闭剂，因为高浓度的蛋白质会干扰探针和靶基因的退火。
(4)杂交过程中根据需要选择不同的振荡方法和程度。当许多杂化膜一起反应时，连续的轻微振荡可以获得更好的杂化结果。
(5)在杂交过程中加入其他化合物，如在反应体系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG，杂交速度可提高约10倍。这种方法通常用于检测稀有序列，但由于溶液的粘度，它们有时会导致高背景和难以操作。因此，除非滤膜中含有的靶DNA的量很少或放射性探针的量有限，否则一般不使用硫酸葡聚糖或PEG。
(6)根据探针和检测目标之间的同源性选择清洁程度。如果有高度同源性，可以选择紧密洗脱模式(高浓度SSC)，否则可以选择非紧密洗脱模式(低浓度SSC)。洗脱通常在低于杂交体12-20℃的解链温度下进行。解链温度(Tm)是指当双链DNA或RNA分子变性形成单独的单链时，吸光度增加的中点温度。通常，富含G C碱基对的序列的Tm温度高于富含at碱基对的序列。Tm的计算方法请参考第8章。
(7)根据标记探针的浓度和比活性，选择不同的杂交条件和检测方法。一般来说，使用新的同位素可以获得强信号。
(8)在水溶液中杂交时，6×SSC和6×SSPE溶液的效果相同。但在甲酰胺溶液中杂交时，应使用缓冲能力更强的6×SSPE。
这些条件的变化对杂交结果有不同的影响，应根据研究的具体条件选择合适的方法。