如何制作QPCR的标准曲线

详情如下:

PCR-ELISA方法:

使用地高辛或生物素作为标记引物，扩增产物被固相板上的特异性探针结合。

然后加入抗地高辛或生物素化抗体-辣根过氧化物酶偶联物，最后酶使底物显色。

常规的PCR-ELISA只是定性实验，加入内标，制作标准曲线也可以达到定量检测的目的。

通过测量一系列已知成分的标准物质的某种理化性质，得到由该性质的数值组成的曲线。

扩展数据:

实时荧光定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累实时监控整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

检测方法:

1，SYBRGreen法:

在PCR反应体系中加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地混入DNA双链中，然后发出荧光信号。

而没有掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线，PCR产物解链曲线(单峰图表示PCR扩增产物的奇异性)。

2.TaqMan探针法:

当探针完整时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收；

在PCR扩增过程中，Taq酶的5’-3’核酸外切酶活性降解探针，并将报告荧光基团与淬灭荧光基团分开，使得荧光监测系统可以接收荧光信号。

即每一条DNA链都被扩增，形成一个荧光分子，实现了荧光信号的积累和PCR产物的形成之间的完全同步。

将PCR反应第一个15循环的荧光信号作为荧光背景信号，默认设置荧光阈值为3-15循环荧光信号标准差的10倍，即阈值= 10 * sdcycle3-15。

使用已知初始拷贝数的标准品可以制作标准曲线，其中横坐标代表初始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样本的Ct值，就可以从标准曲线计算出样本的初始拷贝数。

参考资料:

百度百科-实时荧光定量

百度百科-标准曲线