两个高度保守的基因，怎么做qPCR？

一般来说，实时qPCR MasterMix是2倍浓缩液，只需要加入模板和引物即可。由于实时qPCR的灵敏度较高，每个样本至少要做三个平行孔，防止由于Ct差异较大或SD较大而导致后期数据分析时无法进行统计分析。一般来说，反应体系中铅的最终浓度为100-400mm；模板一般总RNA为10ng-500，cDNA为10倍，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然，这些都是经验值，在操作的过程中，需要根据所用的母料、模板、引物的不同进行优化，以达到一个最优的反应体系。在反应系统配置过程中，有以下几点需要注意:

1.MasterMix不应反复冷冻和解冻。如果经常使用，最好溶解后放在4度。

2.进行更多的混合以减少取样误差。最好在冰上操作。

3.每个管子或孔都应该换上新的枪头！不要用同一个枪头连续加样！

4.所有配料加入后，离心去除气泡。

5.每个样品至少有3个平行孔。

参考染料(被动染料)通常用作ROXTM(现在是ABI的注册商标！)或其他染料，只要不影响被检测PCR产物的荧光值即可。参比染料的作用是规范荧光定量反应中的非PCR振荡，校正上样误差或孔间误差，提供稳定的基线。现在很多公司都把ROXTM配制成MasterMix或者预混料。如果反应曲线良好或反应体系已经优化，可以不加ROXTM染料进行校正。

一般来说，实时qPCR的反应程序不需要像常规PCR那样分三步进行变性、退火和延伸。由于产物长度在80-150bp之间，只需要变性和退火即可。对于SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，增加一个溶解程序，形成溶解曲线，判断PCR产物的具体扩增情况。溶出程序和仪器都有默认设置，或者略有不同，但它们都在产品溶解时收集荧光信号。

3.仪器设置

所有仪器的操作基本相同。设置包括印版设置和程序设置。让我们以ABI第一步为例，详细了解一下反应设置:

A.首先是实验目的的选择:定量还是其他。我们将其命名为“BioTeke”，并进行了“定量”实验。

B.实验方法的选择:我们选择SYBR Green比较Ct法，Fast程序，以cDNA为模板。

c .目标基因的设置:有几个目标基因及其名称。

D.样本设置:包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及阴性对照和生物重复的设定。

e .对照组和参照基因的设置:这是为后面的定量做准备。

F.反应程序的设置:PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。例如，BioTeke可以在95℃下激活DNA聚合酶2分钟(ABI需要10分钟)。循环反应为40个循环，95℃15秒，60℃15秒。溶出曲线程序可以使用仪器的默认设置。或仪器手册中建议的程序。